毛細管氣相色譜法測定森林凋落物中的有機酸

有機酸在土壤養分活化、釋放中的作用日益受到關注，已成為國內外植物營養和土壤學研究的熱點（Fox et a1．，1990b；1992；胡紅青等，1997；陸文龍等，1998；McColl et a1．，1999；Sollins et a1．，1999）。土壤中的有機酸可來自有機質分解、微生物代謝或植物根分泌作用等不同途徑（莫淑勛，1986；沈阿林等，1997）。對于森林土壤來說，森林凋落物的分解和淋溶過程無疑是有機酸的zui主要來源。目前，已有越來越多的研究者注意到森林凋落物分解、淋溶過程中釋放的有機酸并對此進行研究（Pohlman et a1．，1988；Fox et a1．，1990a；王曉水等，1997；吳俊民等，2000），這就要求有準確、快速、簡便的分析檢測方法。
    森林凋落物中有機酸的分析尚無統一方法，研究者采用的主要有液相色譜法和氣相色譜法2大類。用液相色譜法（紫外檢測器）測定有機酸時，檢測波長一般在羧基的zui大吸收峰205nm左右，易受夾雜成分的干擾，引起較大誤差，且需要較為復雜的前處理（Fox et a1．，1990a）；另外在測定小分子有機酸時需要較低的pH值，易引起色譜柱的流失，而脂肪酸又以結合態（甘油三酯）存在，且存在形式不*，無法直接測定，使其游離而不破壞脂肪酸的特性需要復雜的處理過程。應用傳統的氣相色譜法測定有機酸時，前處理大多選用不同溶劑浸提，然后進行濃縮、酯化，這就不可避免地產生易揮發性有機酸在濃縮和酯化過程中的損失以及高溫引起的不飽和脂肪酸的氧化，且由于處理方法的不同，通常僅能分析大分子有機酸，而對低分子有機酸的選擇性較差（王曉水等，1997；吳俊民等，2000）。對于同一種凋落物而言，要想測定出其所含有的低分子量有機酸及脂肪酸，往往需用2種不同方法進行測定，從而導致2種不同方法之間可比性差，容易造成誤差。因此，進行樹種凋落物中各種有機酸的綜合、一次性測定研究就顯得尤為重要。

    本文采用甲醇浸提的同時進行甲酯化處理，用毛細管氣相色譜法進行檢測，建立了一種準確且同時測定森林凋落物中低分子量有機酸和脂肪酸的毛細管氣相色譜法。該方法操作簡便，不需要額外的樣品濃縮處理過程，能同時分析多種低分子量有機酸及脂肪酸。
 

    1 試驗材料

    選擇東北林區主要造林樹種水曲柳（Fraxinus mandshurica）和落葉松（Larix olgensis）的新鮮凋落物為供試材料。于10月上旬在東北林業大學帽兒山實驗林場收集當年新鮮凋落物（L層）。樣品在實驗室內通風陰干，粉碎，裝瓶待測。
  

  2 樣品處理（浸提與甲酯化）

    準確稱取凋落物樣品0.5000g放人干凈的50mL反應瓶中，加人體積之比為7：100的H2S04：CH3OH溶液10mL（劉百戰等，1999），密閉搖勻，置于60％水浴鍋中加熱24h浸提并直接進行甲酯化，然后用布氏漏斗將甲酯化后的樣品抽濾，用甲醇沖洗反應瓶3次，抽濾后合并濾液，轉移到盛有20mL高純水的分液漏斗中。用三氯甲烷萃取（5mL，分3次），分層后下層萃取液經無水*玻璃小柱（玻璃小柱中加人約5mm厚無水*，下端用玻璃纖維固定；無水*及玻璃纖維在250％下烘干4h）干燥，用帶刻度試管接取，直接取1μL進樣分析。
  

  3 儀器設備與色譜條件

    美國Agilent-6890N氣相色譜儀，氫火焰離子化檢測器（FID）。色譜分析條件如下：色譜柱：30m×0.25mm×0.53 μm FFAP彈性石英毛細管柱；柱流速：2.5 mL/min；進樣口溫度：230℃；載氣：氮氣（N2），純度≥99.999％；程序升溫：120℃（保持2 min） 10℃/min→ l60℃，20℃/min→200℃保持20min）；進樣量：1μL；分流比：20：1；檢測器溫度：250℃；尾吹：50mL/min；H2：空氣為40mL/min：450 mL/min。
 

    4 定性分析

    分別取一定濃度的草酸、丙二酸、丁二酸、反丁烯二酸、順丁烯二酸、蘋果酸、檸檬酸、棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸、亞麻酸和花生酸（均為色譜純，Sigma產品）標樣，在上述*色譜條件下，按樣品處理方法進行甲酯化，得到標樣色譜圖，以確定各有機酸峰的位置及不同有機酸所對應的保留時間。在相同色譜條件下，將樣品色譜圖與有機酸標準樣品色譜圖進行對照，根據保留時間確定樣品中各有機酸的色譜峰，進行定性分析；同時還在樣品中加人有機酸標樣，以進一步確定。圖1和圖2分別為水曲柳和落葉松凋落物樣品的典型氣相色譜圖。
    可以看出，水曲柳和落葉松凋落物樣品含有多種有機酸，包括草酸、丙二酸、反丁烯二酸、丁二酸、順丁烯二酸、蘋果酸、棕櫚酸、檸檬酸、硬脂酸、油酸、亞油酸、亞麻酸、花生酸等，其中大部分峰都能得到較好的分離。另外還有部分含量較高的物質未能確認。
 

    定量分析

    應用外標法進行定量分析，用峰面積計算出樣品中各有機酸的含量。為測定該方法的精密度，同一凋落物樣品重復稱樣6次，分別進行甲酯化處理和色譜分析，計算各有機酸含量的平均值和相對標準偏差。另外，采用標準加入法進行有機酸的回收率試驗，并取一定濃度的有機酸標樣進行zui小檢出限測定（S/N=3）。水曲柳凋落物中13種有機酸的定量測定結果及方法的相對標準偏差、回收率、zui小檢出限等參數。
可以看出，所檢測的13種有機酸中有12種相對標準偏差在1.53％～5.30％，只有順丁烯二酸因為含量少，相對標準偏差達到8.54％，但也滿足分析測定的要求；13種有機酸的加標回收率在84.66％～97.45％之間；各有機酸的zui小檢出限為0.89～6.46 ng。
 

   6 結論與討論

    本研究將密封樣品的反應瓶置于60％水浴鍋中，采用甲醇浸提有機酸并直接甲酯化24h，建立了一種準確測定森林凋落物中有機酸的毛細管氣相色譜法。該方法不需要特殊設備及樣品濃縮處理，不但能有效避免傳統測定方法濃縮和酯化過程中易揮發有機酸的損失，以及高溫引起的不飽和脂肪酸的氧化，而且酯化*，樣品轉移簡便，易于操作；用毛細管氣相色譜法進行檢測，選擇性好，能一次性準確測定低分子量有機酸及脂肪酸。實驗表明，該方法分離度好、精密度高、重現性好（保留時間變化在±1.5％以內）、回收率及zui小檢出限均滿足要求，是一種對凋落物樣品中有機酸進行定性、定量分析的可靠方法。
將本文分析結果與王曉水等（1997）、吳俊民等（2ooo）所做的結果進行對比，發現亞油酸所占比例較大這一點是一致的，但其二人均未涉及低分子量有機酸，如草酸、丙二酸、反丁烯二酸、丁二酸、順丁烯二酸、蘋果酸等。Pohlman等（1988）發現北美翠柏（Calocedrus decurrens）、美國黃松（Pinus ponderos0）未分解凋落物亞層中草酸含量zui大，在這點上本研究也與此結果相符。同時還發現Pohlman等（1988）、F0x等（1990a）所檢測的有機酸數量遠低于本文結果，原因很可能在于他們測定有機酸時采用稀NaOH／HNO3，溶液或調節到一定pH值的去離子水進行凋落物淋洗處理，接收淋洗液進行分析，所測得的主要是游離低分子有機酸（脂肪酸以水相溶劑是無法提取的）；而本文則是在60℃密閉條件下，采用甲醇浸提有機酸并直接進行甲酯化，游離有機酸可直接浸提酯化，結合態有機酸亦可在酸的作用下完成酯交換，使游離及結合態有機酸得以同時測定。此外，凋落物中有機酸的專門定性分析采用了氣相色譜一質譜（GC-MS）聯用法，將另文論述。
 

參 考 文 獻

[1]胡紅青，賀紀正，李學垣等．有機酸對酸性土壤吸附磷的影響．華中農業大學學報，1997，16（1）：37—42
[2]劉百戰，徐亮，詹建波等．云南烤煙中非揮發性有機酸及某些脂肪酸的分析．中國煙草科學，1999，（2）：28—31
[3]陸文龍，王敬國，曹一平等．低分子量有機酸對土壤磷釋放動力學的影響．土壤學報，1998，35（4）：493—499
[4]莫淑勛．土壤中有機酸的產生、轉化及對土壤肥力的某些影響．土壤學進展，1986，14（4）：1—10
[5]沈阿林，李學垣，吳受容．土壤中低分子量有機酸在物質循環中的作用．植物營養與肥料學報，1997，3（4）：363—370